本发明公开了链霉菌菌株SPC6-50-1的诱变筛选方法，是通过亚硝基胍对天蓝色链霉菌和链霉菌Lzsg 6进行诱变，得到链霉菌突变体库，再通过利福平及链霉素筛选，得到转录系统和翻译系统发生突变的菌株，并公开了链霉菌菌株SPC6-50-1及其应用。本发明的有益效果为：本发明提供的链霉菌SPC6-50-1菌株具有抑菌活性的物质，而其NTG诱导、利福平和链霉素筛选的方法能够激活链霉菌的一些沉默基因，得到新代谢产物，得到新抗生素，同时，上述诱导筛选方法具有操作简单，周期短，效率高的优点，不仅可适用于链霉菌，也适用于粘细菌等有丰富次级代谢产物的微生物，具有很好的推广使用价值。
1.一株以诱变筛选方法诱变筛选得到的链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1，其特征在于，所述链霉菌的保藏号为CGMCCNo.8372。
2.权利要求1所述的链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1在制备抗生素中的应用。技术领域
本发明涉及抗生素生产领域，具体涉及链霉菌菌株SPC6-50-1的诱变筛选方法、链霉菌菌株SPC6-50-1及其应用。
背景技术
自从1928年人类首次发现抗生素---青霉素以来，在这几十年中，抗生素工业飞速发展，为人类的身体健康做出来巨大的贡献。但由于人们不合理的使用抗生素，尤其是我国，抗生素耐药性的问题逐渐爆发出来。解决这一问题，除了注意抗生素的合理使用外，开发新的对耐药性病菌有抑制活性的新抗生素也是非常重要的。链霉菌是一种广泛存在于自然界，尤其是在土壤中，原核，革兰氏阳性菌，属于放线菌门。链霉菌具有复杂的形态分化和次级代谢，而在营养生长和孢子分化的过渡时期能产生多种具有生物活性的次级代谢产物。该属产生的代谢物除抗生素外，还包括抗肿瘤剂、免疫抑制剂、抗虫剂以及胞外水解酶，如淀粉酶、几丁质酶纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和蛋白酶等。这些次级代谢产物在医疗、农业、食品等领域都具有重要应用。20世纪40年代至今发现的12000余种微生物来源的生物活性物质中，55%以上是由链霉菌产生的，已发现的抗生素中约有70%是由链霉菌产生的。目前临床上应用的抗生素约三分之二来源于链霉菌属。总结过去几十年从链霉菌中得到的抗生素数量，发现90年代以来，人们发现新抗生素的数量急剧减少，这说明传统的通过筛选新链霉菌来得到新抗生素的方法已经遇到了瓶颈（Berdy，2005）。寻找一种新的高效的获得新抗生素方法很有必要。目前，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseμs)等几株链霉菌已经完成了全基因组测序。研究人员发现，链霉菌线性结构的基因中，高度保守的中央核心区基因主要与一些重要的细胞功能相关，而在核心区两侧存在有大量的次生代谢产物基因簇（Chenetal.，2002；Ohnishietal.，2008）。例如：在分析天蓝色链霉菌的基因组，发现有23个参与形成复杂次级代谢产物的基因簇，约占基因组总量的5%（Bentleyetal.，2002），如表1所示为StreptomycescoelicolorA3(2)产次生代谢物基因簇；阿维链霉菌中有30个次级代谢基因簇，占全基因组的6.6%（Ikedaetal.，2003）。因此，从这个角度来讲，整个链霉菌属就是一个庞大的潜在次生代谢产物库。通过某些方法使链霉菌转录、翻译这些基因，并筛选出具有活性物质的次生代谢物是获得新抗生素的一种有效办法（Zazopoμlosetal.，2003）。表1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>在链霉菌中，编码次级代谢特别是抗生素生物合成途径的基因和途径特异性调控蛋白基因常连锁存在。基因簇中常包含一个至多个途径特异性调控基因，它们调控一种或几种具有共同生物合成途径的抗生素的生物合成。如：天蓝色链霉菌产生的放线紫红素和十一烷基菌灵红素的基因表达由其特异转录激活蛋白ActII-ORF4和RedD调控（vanWezelandMcDowall，2011）。在链霉菌中绝大部分次级代谢物合成基因和特异性调控基因都是沉默的，只有在遇到某些特殊环境的时候，相应的特殊代谢途径调控基因能被激活，产生新的代谢产物或者对其生理生化的调节，帮助链霉菌适应环境，度过难关（ChallisandHopwood，2003）。在找到某个潜在化合物的生物合成基因簇后，通过组合生物合成（CombinatorialBiosynthesis）的方法，如将此基因簇进行异源表达；或用酶剪裁修饰或者利用突变的方法改变遗传代谢过程，就有可能得到新的抗生素（Medemaetal.，2011；Okamotoetal.，2003）。于志斌等人使用抗生素对来源于海洋的无活性链霉菌B3054筛选获得了抗肿瘤活性的1株氯霉素抗性和链霉素抗性株。并经活性产物分析，从1株链霉素抗性株发酵物中分离得到5个抗肿瘤活性化合物，其中一个为新天然产物(于志斌,朱天娇，崔承彬等，2006)。因此，通过改变链霉菌遗传代谢途径得到新抗生素是一种非常有效的办法。NTG是亚硝基胍，是一种非常强的化学诱变剂。NTG诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。本发明首先通过超强诱变剂NTG对链霉菌基因组进行诱变，NTG的诱变率能达到百分之几十，而且是随机的，这样就能得到一个比较全面的链霉菌突变体库。然后再利用利福平与链霉素进行筛选。利福平可以与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位结合，抑制细菌RNA的合成，防止该酶与DNA连接，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止。通过利福平筛选，可以高效的得到因转录系统发生突变而能在含有利福平的平板上生长的菌株。这些突变改变了原来的转录系统，转录系统的突变可能会使细菌的内的调控紊乱，因此会使一些沉默基因得到表达，从而有机会得到新抗生素。链霉素是一种氨基糖苷类药，经主动转运通过细菌细胞膜，与细菌核糖体30S亚单位的特殊受体蛋白结合，干扰信息核糖核酸与30S亚单位间起始复合物的形成，抑制蛋白合成。通过链霉素的筛选可以得到翻译系统发生突变的菌株，这些菌株对于蛋白质翻译能力会出现一定程度的改变。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1的诱变筛选方法、链霉菌菌株SPC6-50-1，此菌株是以高效激活链霉菌沉默抗生素基因代谢基因簇的方法得到的。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1的诱变筛选方法，是通过亚硝基胍（NTG）对天蓝色链霉菌（StreptomycescoelicolorA3(2)）和链霉菌（Streptomycessp.）Lzsg6进行诱变，得到链霉菌突变体库，再通过利福平及链霉素筛选，得到转录系统和翻译系统发生突变的菌株。进一步的，上述的链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1的诱变筛选方法，包括有以下步骤：1）化学诱变剂NTG对链霉菌进行诱变：将天蓝色链霉菌（StreptomycescoelicolorA3(2)）和链霉菌（Streptomycessp.）Lzsg6制备为菌悬液，以NTG母液对菌悬液进行诱变，得到NTG处理过的菌悬液；2）以利福平筛选转录系统发生突变的菌株：将步骤1）得到的NTG处理过的菌悬液均匀涂于含有5μg/ml利福平的高氏一号培养基平板上，30℃培养7-15d，将长出的单菌落分别接于装有5mL液体培养基YEME或TSBY的试管中，然后再制备成诱变菌悬液，进行NTG诱变，将处理过的菌悬液均匀涂于含有10μg/ml利福平的高氏一号培养基平板上，反复，进行15μg/ml，20μg/ml，25μg/ml，30μg/ml，35μg/ml，40μg/ml，45μg/ml，50μg/ml的利福平筛选，得到利福平筛选后菌株；3）以链霉素筛选翻译系统发生突变的菌株：将步骤2）得到的利福平筛选后菌株再进行NTG诱变，方法与步骤2）相同，处理过的菌悬液均匀涂于含有5μg/mL链霉素、50μg/mL利福平的高氏一号培养基平板上，30℃培养7-15d，将长出的单菌落分别接于装有5mL液体培养基YEME或TSBY的试管中，然后再制备成诱变菌悬液，进行NTG诱变，将处理过的菌悬液均匀涂于含有10μg/mL链霉素、50μg/mL利福平的高氏一号培养基平板上，反复，利福平浓度均为50μg/mL，链霉素为15μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml，60μg/ml，70μg/ml，80μg/ml，90μg/ml，100μg/ml依次递增，得到链霉素、利福平筛选后的菌株。本发明的第二个目的是提供了一株以上述的诱变筛选方法诱变筛选得到的链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1，所述链霉菌（Streptomyceslinzensis）SPC6-50-1，已于2013年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），链霉菌SPC6-50-1的保藏编号为CGMCCNo.8372。本菌株为革兰氏阳性、不能形成气生菌丝体、营养菌丝体为黄色，37℃培养一周，菌落直径7mm左右。本发明的第三个目的是提供了上述链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1在制备抗生素中的应用。本发明的第四个目的是提供了上述链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1的诱变筛选方法在激活链霉菌沉默基因中的应用。本发明的第五个目的是提供了上述链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1的诱变筛选方法在制备抗生素中的应用。进一步的，上述的应用，是将链霉素、利福平筛选后的菌株于高氏一号平板上划线，收集孢子保存，接于装有液体培养基YEME或TSBY的三角瓶中，在30℃，200r/min的摇床上培养3-7d，12000r/min离心1min，取上清即可。本发明的方法通过NTG对天蓝色链霉菌（StreptomycescoelicolorA3(2)）和链霉菌（Streptomycessp.）Lzsg6进行诱变，得到一个比较全面的链霉菌突变体库，然后通过利福平与链霉素筛选出转录系统以及翻译系统发生突变的菌株，将这些菌株的发酵液进行抑菌活性检测，发现其代谢产物活性较之前有改变，这说明此方法可以激活链霉菌的一些沉默基因，得到新代谢产物，从而得到新抗生素。本发明的有益效果为：本发明提供的链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1具有抑菌活性的物质，而其NTG诱导、利福平和链霉素筛选的方法能够激活链霉菌的一些沉默基因，得到新代谢产物，得到新抗生素，同时，上述诱导筛选方法具有操作简单，周期短，效率高的优点，不仅可适用于链霉菌，也适用于粘细菌等有丰富次级代谢产物的微生物，具有很好的推广使用价值。
附图说明
图1为本发明提供的链霉菌（Streptomyceslinzensis）菌株SPC6-50-1的诱变筛选方法的具体工艺流程图。图2为野生型天蓝色链霉菌（StreptomycescoelicolorA3(2)）及其突变株的抑菌活性对比结果示意图。图3为链霉菌（Streptomycessp.）Lzsg6及其突变株的抑菌活性对比结果示意图。
具体实施方式
实施例1：通过化学诱变剂NTG对链霉菌进行诱变，如图1所示：一、NTG诱变菌种的处理方法：1、培养基及所用溶液的制备：TSBY(1L)：Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g；蔗糖340g；Oxoid酵母抽提物5g；蒸馏水至1000ml。YEME(1L)：Oxoid酵母提取物3g；Oxoid蛋白胨Tryptone5g；麦芽提取物3g；葡萄糖10g；蔗糖340g；MgCl₂-6H₂O(单独灭菌)；蒸馏水至1000ml。pH6.0磷酸缓冲液：K₂HPO₄2g/L，KH₂PO₄8g/L，0.1MPa灭菌20min。NTG母液的制备：称取0.1gNTG加助溶剂甲酰胺或丙酮1mL，然后加入0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液9mL，配置成10mg/mL的NTG母液。2、菌种制备：实验菌种为天蓝色链霉菌StreptomycescoelicolorA3(2)和Streptomycessp.Lzsg6（分离自甘肃临泽（N39°22′02.52″E100°07′46.68″）沙生芦苇根际土）。将菌株接于装有5mL液体培养基YEME或TSBY的试管中，在30℃，200r/min的摇床上培养3-7d，能直接观察到明显絮状菌丝体。3、诱变菌悬液的制备：取培养液至2mLdoff管中，8000r/min离心1min，用pH6.0的0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤两次，然后重悬于2mLpH6.0的缓冲悬液。二、NTG诱变处理筛选：在菌悬液中加入NTG母液，使其终浓度为1mg/mL，处理60min。处理完毕，将菌悬液8000r/min离心1min，用pH6.0的0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于2mLpH6.0的缓冲悬液。实施例2：通过利福平筛选转录系统发生突变的菌株：将NTG处理过的菌悬液均匀涂于含有5μg/ml利福平的高氏一号培养基平板上，30℃培养7-15d，将长出的单菌落分别接于装有5mL液体培养基YEME或TSBY的试管中，然后再制备成诱变菌悬液，进行NTG诱变，将处理过的菌悬液均匀涂于含有10μg/ml利福平的高氏一号培养基平板上，如此反复，进行15μg/ml,20μg/ml,25μg/ml,30μg/ml,35μg/ml,40μg/ml,45μg/ml,50μg/ml的利福平筛选，得到对利福平不敏感的菌株。实施例3：通过链霉素的筛选翻译系统发生突变的菌株：将利福平筛选过的菌株再进行NTG诱变，方法同上，处理过的菌悬液均匀涂于含有5μg/mL链霉素、50μg/mL利福平的高氏一号培养基平板上，30℃培养7-15d，将长出的单菌落分别接于装有5mL液体培养基YEME或TSBY的试管中，然后再制备成诱变菌悬液，进行NTG诱变，将处理过的菌悬液均匀涂于含有10μg/mL链霉素、50μg/mL利福平的高氏一号培养基平板上，如此反复，利福平浓度均为50μg/mL，链霉素为15μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml,60μg/ml,70μg/ml,80μg/ml，90μg/ml,100μg/ml依次递增，得到对链霉素、利福平均不敏感的菌株。实施例4：菌株产抗生素的检测：一、发酵液的制备：将得到的对链霉素、利福平均不敏感的菌株在没有抗性的高氏一号平板上划线，收集孢子保存，接于装有液体培养基YEME或TSBY的三角瓶中，在30℃，200r/min的摇床上培养3-7d，12000r/min离心1min，取上清。二、抑菌活性测定：上清液抑菌活性测定采用牛津杯法。实验菌种为大肠杆菌（Escherichiacoli）和枯草芽孢杆菌(Bacillμssμbtilis)。制备含有这两种菌的牛肉膏蛋白胨琼脂平板，在牛津杯中加入上一步得到的发酵液上清，37℃培养16h，用直尺测量抑菌圈大小。以野生型StreptomycescoelicolorA3(2)和Streptomycessp.Lzsg6的发酵液上清为对照，结果如图2和图3所示。图2中，以菌株2发酵液上清对大肠杆菌的抑菌圈直径为100%，菌株1-9为StreptomycescoelicolorA3(2)通过此方法得到的9个突变株。图3中，以野生型StreptomycescoelicolorA3(2)的发酵液上清对大肠杆菌的抑菌圈直径为100%，菌株1-6为Streptomycessp.Lzsg6通过此方法得到的6个突变株。从图2和图3的结果可以看出，经此方法处理后，野生型StreptomycescoelicolorA3(2)抑菌活性发生了很大改变，其突变株2的抑菌活性约为野生型的6倍。野生型Streptomycessp.Lzsg6本身几乎没有抑菌活性，经此方法处理后，其突变株2、4、5都有了明显的抑菌活性，说明突变株产生了具有抑菌活性的物质。这说明此方法能激活链霉菌的一些沉默基因，得到新代谢产物。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。